Identification and expression analysis of the AcSWEET gene family in Actinidia chinensis Planch.
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摘要:
SWEET（Sugars will eventually be exported transporters）是近年来在植物中发现的一组糖转运蛋白，在植物生长、发育和非生物及生物胁迫响应等多种生理过程中发挥着重要作用。本研究利用生物信息学方法对猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）AcSWEET基因家族进行了鉴定，共获得29个AcSWEET基因，并对其氨基酸数量、相对分子量、等电点、不稳定系数、亚细胞定位、亲水指数进行了分析。结果显示：29个基因编码的氨基酸数目为680~906个；分子量范围为7.531~101.266 kDa，等电点在6.95~9.90，多数蛋白为定位于细胞膜的疏水性蛋白，具有1~2个MtN3结构域或PQ-loop结构域。此外，AcSWEET基因的外显子数量在4~6个，系统进化分析结果表明猕猴桃AcSWEET基因家族被分为4个亚族，同一亚族基因具有相似的内含子、外显子以及保守基序。表达模式分析结果表明，这些基因在果实不同发育时期具有表达特异性。推测AcSWEET26、AcSWEET7、AcSWEET15和AcSWEET13可能参与猕猴桃的蔗糖转运和积累。
Abstract:The sugar will eventually be exported transporters (SWEET) are a recently discovered group of sugar transporters in plants, which play important roles in various physiological processes, such as plant growth, development, and abiotic and biotic stress. This study aimed to characterize the Actinidia chinensis Planch. SWEET gene family and analyze its expression during fruit development using bioinformatics methods. A total of 29 AcSWEET genes were identified, and their amino acid quantity, relative molecular weights, isoelectric points, instability coefficients, subcellular localizations, and hydrophilicity indices were analyzed. Results showed that the 29 AcSWEET genes encoded proteins with amino acid lengths ranging from 680 to 906 residues, molecular weights between 7.531 kDa and 101.266 kDa, and isoelectric points between 6.95 and 9.9. Most proteins were relatively stable hydrophobic, and localized on the cell membrane, containing 1–2 MtN3 domains. Additionally, gene structure, conserved motifs, evolutionary relationships, cis-regulatory elements, and expression patterns at different developmental stages of fruit development were systematically analyzed. Results indicated that the AcSWEET genes had 4–6 exons. Phylogenetic analysis revealed that the kiwifruit SWEET gene family was divided into four subgroups, responsible for transporting glucose, fructose, and sucrose. Genes within the same subgroup shared similar intron-exon structures and conserved motifs. Expression pattern analysis during kiwifruit development indicated that the AcSWEET genes exhibited stage-specific expression. We speculated that AcSWEET26, AcSWEET7, AcSWEET15, and AcSWEET13 may be involved in sucrose transport and accumulation in kiwifruit.
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Keywords:
- Actinidia chinensis /
- SWEET gene /
- Gene family /
- Gene expression analysis
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糖类不仅可作为植物体的能源物质和结构物质，同时也是决定果实品质的重要因素之一。猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）是猕猴桃科猕猴桃属（Actinidia）的一种多年生藤本落叶果树，具有重要的营养和经济价值，商业化推广以来逐渐成为全球消费的流行水果。由于富含维生素C、膳食纤维、矿物质元素以及其他营养成分，猕猴桃也被誉为“水果之王”[1, 2]。猕猴桃果实的甜度及酸度是评价果实品质的重要因素。在植物中，糖最初在源器官（叶片）中通过光合作用生成，再通过韧皮部筛管和伴胞长距离输送到库器官（花、果实以及种子）供植物生长发育[3]。在此过程中，转运蛋白起着重要作用。目前已经在植物体中发现了3种糖转运蛋白：单糖转运蛋白（MST）[4]、蔗糖转运蛋白（SUT）[5, 6]以及糖外排转运蛋白（Sugars will eventually be exported transporters，SWEET）[7, 8]。
SWEET是一类新发现的、不依赖能量的糖转运蛋白[9, 10]。SWEET蛋白首先在海鞘中被发现，后被发现存在于所有生物体中，包括高等真核生物、原生动物、后生动物、真菌、细菌和古细菌等，在不同生物中具有不同的生理作用[11]。植物中，SWEET蛋白首先在拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh）中被鉴定[7]。真核生物的SWEET蛋白结构具有7次跨膜α螺旋（TMH），由两个连续的MtN3和其中一个连接的TMH组成（3+1+3）[12, 13]。最初被称为MtN3蛋白，后来发现该蛋白在糖转运中起作用，因而改名为SWEET蛋白。系统发育分析表明，SWEET蛋白被分为4个亚族，亚族Ⅰ和Ⅱ负责转运已糖[10, 12]，亚族Ⅲ负责转运蔗糖[14]，亚族Ⅳ主要负责转运果糖[15]。
随后，对植物中SWEET基因的研究也逐步深入。小麦（Triticum aestvum L.）基因组中共鉴定出59个SWEET基因，这些基因对茎锈病可能具有一定的作用[16]。番茄（Solanum lycopersicum L.）基因组中鉴定出29个SWEET基因，其中SlSWEET7a和SlSWEET14编码产物定位于质膜上，参与果实中果糖、葡萄糖和蔗糖的运输和积累[17]。棉花（Gossypium hirsutum L.）和玉米（Zea mays L.）基因组中分别鉴定出55和24个SWEET基因，且发现大部分基因可能增强植物对各种非生物胁迫的适应性[18, 19]。从菠萝（Ananas comosus （L.） Merr）基因组中鉴定出39个SWEET基因，其中AnmSWEET5和AnmSWEET11在果实发育过程中表现出最高的转录水平[20]。在两个二倍体和1个六倍体甘薯（Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill）中，共鉴定出79个SWEET基因，发现同源基因在种间存在差异性，并在植物生长、块根发育、类胡萝卜素积累、激素串扰和非生物胁迫反应中起重要作用[21]。通过同源比对，在柑橘（Citrus reticulata Blanco）中鉴定出27个SWEET基因，其中，CitSWEET1~CitSWEET4、CitSWEET7、CitSWEET25和CitSWEET27具有组织特异性，CitSWEET3在EMY4000酵母菌株中转运葡萄糖[22]。在核桃（Juglans regia L.）中鉴定到25个SWEET基因，发现SWEET介导的宿主糖易位不是核桃枯萎病发展的触发因素[23]。从黄瓜（Cucumis sativus L.）基因组中发现17个SWEET基因，其中，CsSWEET7a、CsSWEET7b和CsSWEET15可能参与了果实中糖的积累[24]。在梨（Pyrus bretschneideri Rehder）基因组中鉴定出18个SWEET基因，其中PbSWEET5与果实发育过程中蔗糖的积累呈负相关[25]。此外，李（Prunus salicina Lindl.）[26]、橡胶（Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg.）[27]、石榴（Punica granatum L.）[28]以及龙眼（Dimocarpus longan Lour.）[29]等的SWEET基因家族也相继被报道。最近研究发现，在猕猴桃果实发育过程中，随着SWEET9b基因表达量的提高，果实中蔗糖的含量也在不断地升高，表明SWEET转运蛋白在猕猴桃果实生长过程中对糖转运及积累具有一定的作用[30]。因此，鉴定猕猴桃AcSWEET基因，探究其在不同发育阶段的表达模式，对研究猕猴桃糖转运具有重要意义。
目前，猕猴桃中仅有SWEET9b基因在蔗糖积累中的分子作用机制比较明晰。为了进一步发掘更多与猕猴桃果实糖转运相关的AcSWEET基因，深入研究糖转运的分子机制，本文对猕猴桃基因组进行了分析鉴定，获得29个AcSWEET基因；并通过转录组数据分析，了解它们在不同发育时期果实中的表达情况，以期进一步解析AcSWEET基因参与猕猴桃果实糖转运的调控机制。
1. 材料与方法
1.1 材料及取样
‘东红’猕猴桃采自中国科学院武汉植物园猕猴桃种质资源圃。根据资源圃历年考种数据，采集‘东红’猕猴桃花后20、60、100和140 d共4个发育时期的果实，每个发育时期选择3棵长势相近且管理水平相同的果树，随机选取30个无机械损伤和病虫害的果实，每10个果实为一组。将每组果肉切成小块混匀，存于−80 ℃冰箱，用于转录组测序和荧光定量实验。
1.2 猕猴桃AcSWEET基因家族成员的鉴定及基因结构分析
从拟南芥数据库（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）下载17个AtSWEET蛋白序列作为查询序列。从Kiwifruit Omics数据库下载‘东红’猕猴桃基因组及注释信息，利用TBtools软件[31]在猕猴桃基因组蛋白序列中进行搜索，获得AcSWEET基因家族的候选序列。确定基因家族成员后，利用TBtools软件中的Protein Paramter Calc功能进行蛋白理化性质的分析。使用DeepTMHMM（https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM）在线软件预测AcSWEET家族成员的跨膜结构域。此外，从NCBI上分别下载拟南芥、水稻（Oryza sativa L.）OsSWEET蛋白的氨基酸序列用于后续的序列比对。使用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）在线软件分析AcSWEET基因家族的基因结构。
1.3 猕猴桃AcSWEET蛋白结构域、保守基序分析
利用MEME在线网站（https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html）对猕猴桃AcSWEET蛋白的Motifs进行识别，Motifs的最大设置值为10。使用在线工具NCBI conserved domains （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进一步分析蛋白的保守结构域。利用TBtools软件对结果进行可视化处理。通过WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）网站进行亚细胞定位预测。
1.4 进化分析及染色体共线性分析
利用Clustal X软件将拟南芥、水稻、猕猴桃SWEET家族的氨基酸序列进行比对，然后基于MEGA11软件中的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树，参数使用默认值，Bootstrap 值设置为1 000次。利用TBtools软件进行染色体共线性分析。
1.5 顺式作用元件分析
用TBtools软件提取AcSWEET基因转录起始位点上游2 000 bp的序列，然后利用PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线软件进行顺式作用元件分析，利用TBtools软件进行可视化。
1.6 猕猴桃SWEET基因家族蛋白互作（PPI）网络分析
使用在线数据库STRING（https://cn.string-db.org/）对猕猴桃AcSWEET蛋白进行蛋白质互作网络分析，有机体选择为自动检测后再选择拟南芥进行比对，得到可视化结果。
1.7 猕猴桃AcSWEET基因表达分析
对‘东红’猕猴桃花后20、60、100和140 d共4个发育时期的果实构建转录组数据库，采用HTSeq软件对样品进行基因表达水平分析，统计猕猴桃果实AcSWEET基因的表达丰度FPKM （Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）。利用TBtools软件基于log2 （FPKM）值绘制基因表达热图。
1.8 荧光定量实验
利用HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒（Magen，广州）提取猕猴桃果实的总RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，北京）进行反转录获得cDNA。使用Premire 5.0软件设计候选基因的引物，以猕猴桃Actin作为内参基因[32]（表1）。使用QuantStudio6·Flex平台进行荧光定量实验，利用2−ΔΔCT方法计算表达量。
表 1 实时荧光定量PCR引物Table 1. Quantitative real-time polymerase chain reaction primers基因名称
Gene name正向引物 （5′–3′）
Forward primer反向引物（5′–3′）
Reverse primerAcSWEET7 TAGTCGTTGGATGGGTTTGC TGCGGTCATTGTAAGGAAAA AcSWEET13 ATAAGAAGAAATCAACCGAAGG GCAGCAAATACGCTCACAGA AcSWEET15 GAGTCACGATTGTCGGATGG TTGGAGCTTCACTTCTGGTAGA AcSWEET26 CACCCTTCTCATCACCATCA TAGGCAAATCCAACCAACAA AcSWEET29 CACATCCCTATTATCAAACG AAATTCTGGTAGAACCTGCT Actin GTGCTCAGTGGTGGTTCAA GACGCTGTATTTCCTCTCAG 2. 结果与分析
2.1 猕猴桃AcSWEET基因家族成员的鉴定及结构分析
对猕猴桃全基因组数据库进行筛选，共鉴定出29个AcSWEET基因家族成员，根据其在染色体上的位置及顺序，依次命名为AcSWEET1~AcSWEET29（图1）。AcSWEET基因家族成员编码的氨基酸数在68~906 aa。29个成员中，有20个定位在质膜，4个定位在液泡，3个定位在叶绿体，1个定位在细胞质，1个定位在细胞核。编码蛋白的等电点为6.95（AcSWEET2）~9.91（AcSWEET10），相对分子量在7 531.83~
101 266.08 Da。此外，分析发现，AcSWEET11、AcSWEET20和AcSWEET27为脂溶不稳定蛋白，AcSWEET11和AcSWEET20为亲水不稳定蛋白（表2）。表 2 AcSWEET基因家族成员信息Table 2. Information on AcSWEET gene family members基因
Gene序列ID
Sequence ID蛋白质长度
Number of amino acids分子量
MW / Da等电点
Theoretical pI不稳定系数
Instability index脂溶指数
Aliphatic index亲水指数
Hydrophobicity scales亚细胞定位
Subcellular localization染色体位置
Chromosome locationAcSWEET1 Ach05g06950DH 68 7 531.83 8.03 29.09 117.65 0.469 叶绿体 5 AcSWEET2 Ach06g07770DH 245 2 7196.90 6.95 47.57 103.39 0.568 质膜 6 AcSWEET3 Ach06g08520DH 236 26 023.09 9.36 35.65 119.36 0.876 液泡膜 6 AcSWEET4 Ach10g04100DH 253 27 658.05 9.57 29.51 114.82 0.590 质膜 10 AcSWEET5 Ach10g10290DH 236 26 340.97 9.31 35.04 95.42 0.163 细胞核 10 AcSWEET6 Ach11g04370DH 252 27 746.95 9.37 34.26 109.44 0.512 质膜 11 AcSWEET7 Ach13g04100DH 288 32 042.07 6.99 36.66 120.14 0.694 质膜 13 AcSWEET8 Ach13g17010DH 234 25 814.53 8.80 36.02 111.58 0.684 质膜 13 AcSWEET9 Ach14g03170DH 198 21 765.16 9.71 29.99 120.51 0.703 质膜 14 AcSWEET10 Ach14g03210DH 186 20 525.26 9.91 31.15 117.96 0.334 质膜 14 AcSWEET11 Ach16g04520DH 103 11 850.58 4.93 40.50 73.79 −0.449 细胞质 16 AcSWEET12 Ach16g04530DH 136 15 558.83 9.44 31.10 129.78 0.856 质膜 16 AcSWEET13 Ach16g04540DH 287 32 139.66 9.39 38.65 117.46 0.778 质膜 16 AcSWEET14 Ach16g06160DH 238 26 764.96 9.10 37.01 115.46 0.671 质膜 16 AcSWEET15 Ach17g10410DH 275 30 968.82 7.61 35.74 111.35 0.656 质膜 17 AcSWEET16 Ach17g10420DH 132 14 617.52 9.08 49.24 108.71 0.679 叶绿体 17 AcSWEET17 Ach18g07250DH 250 28 204.71 9.37 44.39 115.76 0.554 质膜 18 AcSWEET18 Ach19g02550DH 296 33 224.04 8.46 35.78 130.57 0.841 质膜 19 AcSWEET19 Ach19g10330DH 304 33 198.18 9.49 29.29 111.48 0.346 质膜 19 AcSWEET20 Ach19g11300DH 906 101 266.08 9.61 46.80 86.35 −0.272 质膜 19 AcSWEET21 Ach21g07220DH 252 27 533.77 9.59 28.91 114.17 0.663 质膜 21 AcSWEET22 Ach23g12130DH 235 26 009.82 9.30 45.47 118.64 0.802 液泡膜 23 AcSWEET23 Ach24g12310DH 244 27 010.81 8.48 35.30 116.23 0.618 质膜 24 AcSWEET24 Ach25g05410DH 259 28 487.96 9.63 43.00 115.52 0.558 液泡膜 25 AcSWEET25 Ach26g07610DH 183 20 725.66 8.49 41.84 114.48 0.680 液泡膜 26 AcSWEET26 Ach26g09140DH 290 32 463.83 8.77 38.39 114.93 0.722 质膜 26 AcSWEET27 Ach26g09150DH 340 38 910.41 9.24 48.76 88.85 0.107 质膜 26 AcSWEET28 Ach27g01830DH 81 9 064.60 9.30 39.94 101.11 0.251 叶绿体 27 AcSWEET29 Ach28g11120DH 261 29 612.67 8.97 37.55 117.36 0.777 质膜 28 注：亲水指数为负值表示亲水性，正值表示疏水性；不稳定指数大于 40 为不稳定蛋白；脂溶指数小于 100 为脂溶蛋白。 Notes: For total average hydrophilicity, a negative value indicates hydrophilicity, while a positive value indicates hydrophobicity; Instability index greater than 40 indicates an unstable protein; Lipid solubility index less than 100 indicates lipid soluble protein. 对不同成员的基因结构进行分析（附图1
1 ）），发现AcSWEET基因间的结构差异较大，其外显子数量为2（AcSWEET1、AcSWEET11）~16个（AcSWEET20），大部分成员的外显子数量为4~6个，而AcSWEET20则具有16个外显子。2.2 猕猴桃AcSWEET蛋白结构域、保守基序分析
MtN3和PQ-loop是AcSWEET家族成员蛋白的保守结构，均具有糖转运的功能。经鉴定，AcSWEET蛋白大多具有这两种结构。除了AcSWEET10蛋白不具有此结构，AcSWEET1、AcSWEET9、AcSWEET11、AcSWEET12、AcSWEET16、AcSWEET25和AcSWEET28仅有1个MtN3或PQ-loop结构域外，其他蛋白均具有两个MtN3或PQ-loop结构域，同时，AcSWEET20蛋白还含有1个Bromodomain 超家族结构（附图2
1 ））。利用MEME在线工具分析保守区域基序，发现猕猴桃AcSWEET家族成员含有10个基序，分别称其为Motif1~Motif10。其中，SWEET1、SWEET11和SWEET28仅含有1~2个Motif。大多数家族成员含有共同的Motif，其中AcSWEET7、AcSWEET13、AcSWEET15、AcSWEET18、AcSWEET26、AcSWEET29含有9个相同的 Motif，保守性最强。AcSWEET2~AcSWEET4、AcSWEET19、AcSWEET21~AcSWEET24、AcSWEET27含有8个Motif，且只有AcSWEET4的Motif种类与其他成员不同，保守性次之。AcSWEET6、AcSWEET8、AcSWEET14、AcSWEET17均含有7个Motif，且仅有AcSWEET8的Motif种类与其他三者不同（附图3
3 ）），保守性较强。整体上看，这26个成员的的氨基酸序列保守性较强。对29个AcSWEET家族成员的氨基酸序列进行跨膜区预测，结果显示，AcSWEET11没有跨膜区，为非跨膜蛋白。其余AcSWEET蛋白均含有多个跨膜区，属于跨膜蛋白。
2.3 进化分析及共线性分析
为了研究猕猴桃AcSWEET基因家族的进化关系，利用拟南芥和水稻的SWEET家族蛋白序列构建了系统进化树。结果表明，这些SWEET基因被分成4个亚族（图2）。绝大多数成员被聚类在亚族Ⅰ和Ⅱ中，其中，亚族Ⅰ包含3个AtSWEET基因、7个OsSWEET基因和6个AcSWEET基因。亚族Ⅱ包含5个AtSWEET基因、7个OsSWEET基因和7个AcSWEET基因。亚族Ⅲ包含7个AtSWEET、5个OsSWEET和9个AcSWEET。而亚族Ⅳ的成员最少，包含来自拟南芥的3个、水稻的1个和猕猴桃的5个成员。从进化树中可以看出，猕猴桃的SWEET蛋白序列与拟南芥的相似度较高。
猕猴桃29个AcSWEET基因分布在29条染色体中的17条上，其中，Chr16上包含的基因数量最多，为4个；Chr19和Chr26上各有3个；而Chr01~Chr04、Chr07~Chr09、Chr12、Chr15、Chr20、Chr22和Chr29上没有AcSWEET基因的分布（附图4
4 ））。同时，共线性分析结果发现，AcSWEET基因家族存在16个片段重复事件，说明在进化过程中存在基因复制。此外，29个AcSWEET基因家族成员中共存在16个共线性基因对。2.4 顺式作用元件
顺式作用元件分析结果表明（图3），AcSWEET基因家族启动子区域含有较多与植物激素响应相关的元件。如茉莉酸响应MeJA和脱落酸响应ABRE，以及水杨酸反应、赤霉素反应、生长素响应等相关元件。此外还含有很多逆境相关元件，如干旱、低温、厌氧等。同时还发现了一些植物生长协调过程中的元件，如昼夜调节，细胞周期、胚乳表达和种子特异性调节等。由此可知，AcSWEET基因启动子区域顺式作用元件众多，可能在不同条件下调控AcSWEET基因的功能。
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图 3 AcSWEET基因家族启动子顺式作用元件Figure 3. Cis-regulatory elements of AcSWEET gene family promoters2.5 猕猴桃AcSWEET家族蛋白质互作PPI网络分析
利用分子互作网络检索工具预测AcSWEET蛋白互作特性，结果显示整个蛋白互作网络共有9个节点，节点间存在8组蛋白互作关系。每个蛋白节点与其他蛋白节点都有一定的互作关系（附图5
5 ）），其中AcSWEET8位于整个家族蛋白互作网络的中心，分别与7个家族成员蛋白产生相互作用。值得注意的是，AcSWEET8与AcSWEET6 和AcSWEET29蛋白两两互作。此外，AcSWEET7与其他蛋白家族成员没有互作关系。2.6 猕猴桃AcSWEET基因在果实不同时期的表达特征分析
为进一步分析基因在果实发育不同时期的表达特征，根据‘东红’猕猴桃果实开花后20、60、100和140 d的转录组测序数据，对AcSWEET基因的表达量进行了分析（图4）。结果发现，AcSWEET6、AcSWEET19、AcSWEET23、AcSWEET27、AcSWEET18、AcSWEET28在果实发育20 d时表达量最高，此后随着时间的增加，表达量降低；随着果实的发育，AcSWEET8、AcSWEET20、AcSWEET24、AcSWEET22 的表达量逐渐增加，至60 d后开始降低。值得注意的是，AcSWEET7和AcSWEET25在果实发育早期和后期几乎不表达，而在花后100 d时表达量达到最高。AcSWEET13、AcSWEET21、AcSWEET29、AcSWEET26、AcSWEET7、AcSWEET15在整个果实发育过程中的表达量呈上升趋势，并在140 d时达到最高。
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图 4 不同发育阶段猕猴桃AcSWEET基因家族表达量分析Figure 4. Expression levels of AcSWEET gene family at different developmental stages2.7 荧光定量PCR分析
对猕猴桃AcSWEET基因家族成员进行序列比对，发现本研究中根据在染色体上的位置，顺序命名的AcSWEET29基因与前人报道的猕猴桃SWEET9b为同一基因[30]。此外，系统进化分析结果表明，AcSWEET26、AcSWEET7、AcSWEET15、AcSWEET13与AcSWEET29为同一个亚族，且表达水平相近，因此这4个基因可能与AcSWEET29具有相似的功能。为了验证转录组数据的准确性，本文通过荧光定量PCR实验对这5个基因进行了表达量分析，并将其相对表达水平与各自的FPKM值进行比较。结果表明，转录组数据中的表达量与qRT-PCR得到的相对表达量变化趋势基本符合（图5）。
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图 5 AcSWEET基因在猕猴桃果实不同发育时间的表达分析A为FPKM值， B为荧光定量PCR结果。不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。Figure 5. Expression analysis of AcSWEET genes at different developmental stagesA shows FPKM values, B shows result of qRT-PCR. Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level.2.8 猕猴桃果实糖含量和组分测定及相关性分析
不同发育时期果实糖含量及组分的测定结果表明，随着猕猴桃果实的发育，葡萄糖、果糖及蔗糖含量均呈逐渐增加的趋势（图6）。葡萄糖含量最高，果糖含量次之，蔗糖含量最低，且3种糖含量之间的相关性显著。将糖含量与候选基因进行相关性分析，结果显示AcSWEET29与3种糖含量之间显著正相关（表3），此外，AcSWEET7、AcSWEET13、AcSWEET15与3种糖含量也呈显著正相关。而AcSWEET26与3种糖含量的关系不显著，但与AcSWEET15呈显著正相关。
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图 6 ‘东红’猕猴桃果实蔗糖、果糖及葡萄糖含量Figure 6. Sucrose, fructose and glucose contents in ‘Donghong’ fruit表 3 猕猴桃果实发育过程中糖含量及候选基因的相关性Table 3. Correlation of sugar content and candidate genes at different developmental stages指标
Item蔗糖
Sucrose葡萄糖
Glucose果糖
FructoseAcSWEET7 AcSWEET13 AcSWEET15 AcSWEET26 AcSWEET29 蔗糖 1 葡萄糖 0.960** 1 果糖 0.977** 0.975** 1 AcSWEET7 0.754** 0.664* 0.751** 1 AcSWEET13 0.677* 0.698* 0.694* 0.466 1 AcSWEET15 0.773** 0.686* 0.776** 0.972** 0.411 1 AcSWEET26 0.541 0.467 0.549 0.542 0.397 0.693* 1 AcSWEET29 0.904** 0.836** 0.915** 0.910** 0.566 0.934** 0.647* 1 Notes: *: P<0.05; **: P<0.01. 3. 讨论
SWEET家族蛋白结构保守，可介导韧皮部薄壁组织中的糖流入或流出质外体，进而将糖输送到植物各个器官和组织。研究表明SWEET基因在多种园艺作物果实发育和成熟过程中起糖转运作用。本研究从猕猴桃基因组数据库中鉴定到29个AcSWEET基因，不均匀地分布在17条染色体上。基因结构分析发现，这些基因的外显子数量在5~7个，Motif数量多为7~9个，且具有相同的Motif种类，基因保守性较强。蛋白结构分析表明， 29个AcSWEET蛋白中共有21个具有两个MtN3或PQ-loop结构域，7个仅含有1个MtN3或PQ-loop结构域，这可能是由于AcSWEET蛋白在进化过程中发生了复制、融合或遗传丢失。
分析猕猴桃与拟南芥以及水稻SWEET基因家族成员的系统进化关系，并进行聚类分析，发现猕猴桃的SWEET基因家族成员可被分为4个亚族。其中亚族Ⅰ包含6个基因，主要负责转运葡萄糖[10]；亚族Ⅱ包含7个基因，也负责葡萄糖的转运[12]；亚族Ⅲ包含9个基因，主要负责转运蔗糖[14]；亚族Ⅳ包含5个基因，主要负责转运果糖[15]，同一亚族成员具有相似的结构和功能。在进化过程中，基因家族通常会经历串联复制或大规模分段复制，以保持每个家族的进化性。本研究发现，AcSWEET基因家族中29个成员之间共存在16个共线性基因对，表明家族成员在进化中发生了片段复制。杨 （Populus przewalskii Maxim）bZIP家族中也出现过类似的基因片段重复事件[33]。基因家族成员在不同染色体中具有多个片段复制，可能导致同一家族基因具有相似的功能。
基因的表达与上游启动子也有着密切的关系。苹果（Malus pumila Mill.）中MdFRK2是决定果糖激酶（FRK）活性和果糖代谢的关键基因，该基因上游1 730 bp序列中存在众多与环境胁迫和光响应有关的作用元件，同时也包含与糖代谢相关的基序[34]。本文通过对上游2 000 bp启动子的预测发现，猕猴桃AcSWEET基因成员至少具有5个激素响应的顺式作用元件，表明相应的激素处理可能对其具有调节作用。同时，这些基因启动子区域还存在低温反应以及干旱诱导相关的顺式作用元件，表明该基因家族成员可能在逆境反应中发挥一定的作用。此外，预测还发现启动子区域存在胚乳表达、细胞周期以及种子特异性相关的顺式作用元件，推测该基因家族可能在植物的生长发育过程中起调节作用。研究表明，互作蛋白可共同作用调控代谢途径，如玉米中BBX家族成员ZmBBX15、ZmBBX24和ZmBBX33可与5个以上其他ZmBBX成员互作，这些BBX与COP40的WD1基序结合，从而调节光形态发生的不同亲和力[35]。
猕猴桃SWEET家族蛋白互作预测结果表明，AcSWEET29、AcSWEET6和AcSWEET8之间存在两两互作，而AcSWEET29是一个定位于细胞膜的蔗糖转运蛋白，且AcSWEET29的表达量随着果实成熟和蔗糖含量的升高而逐渐增加[30]。据此推测，AcSWEET6和AcSWEET8可能也在猕猴桃果实的糖转运过程中起作用。值得注意的是，这两个基因分别在果实发育20和60 d时表达量最高，在果实发育后期表达量逐渐降低，这与AcSWEET29的表达趋势相反，因此，AcSWEET6和AcSWEET8可能在猕猴桃果实发育的前期起作用。
基因表达分析结果表明，在猕猴桃果实不同发育时期，AcSWEET基因的表达水平差异明显。表达水平聚类分析发现， 在果实发育20和140 d时，分别有7个基因的表达水平最高，推测AcSWEET基因主要在果实发育初期和成熟期发挥调控功能。在果实发育60和100 d 时，也有AcSWEET基因表现出较高的表达水平，可能该基因家族在糖积累过程中都起重要作用。此外，分析候选基因表达水平与糖含量之间的关系，发现AcSWEET26、AcSWEET7、AcSWEET15、AcSWEET13及AcSWEET29与蔗糖、果糖及葡萄糖含量之间均存在显著正相关，推测这些基因可能在猕猴桃果实发育过程中起糖积累的作用，但其具体功能还有待深入研究。本研究鉴定的AcSWEET基因可为该家族的功能研究和猕猴桃品质改良提供分子基础。
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图 3 AcSWEET基因家族启动子顺式作用元件
Figure 3. Cis-regulatory elements of AcSWEET gene family promoters
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图 4 不同发育阶段猕猴桃AcSWEET基因家族表达量分析
Figure 4. Expression levels of AcSWEET gene family at different developmental stages
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图 5 AcSWEET基因在猕猴桃果实不同发育时间的表达分析
A为FPKM值， B为荧光定量PCR结果。不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 5. Expression analysis of AcSWEET genes at different developmental stages
A shows FPKM values, B shows result of qRT-PCR. Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level.
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图 6 ‘东红’猕猴桃果实蔗糖、果糖及葡萄糖含量
Figure 6. Sucrose, fructose and glucose contents in ‘Donghong’ fruit
表 1 实时荧光定量PCR引物
Table 1 Quantitative real-time polymerase chain reaction primers
基因名称
Gene name正向引物 （5′–3′）
Forward primer反向引物（5′–3′）
Reverse primerAcSWEET7 TAGTCGTTGGATGGGTTTGC TGCGGTCATTGTAAGGAAAA AcSWEET13 ATAAGAAGAAATCAACCGAAGG GCAGCAAATACGCTCACAGA AcSWEET15 GAGTCACGATTGTCGGATGG TTGGAGCTTCACTTCTGGTAGA AcSWEET26 CACCCTTCTCATCACCATCA TAGGCAAATCCAACCAACAA AcSWEET29 CACATCCCTATTATCAAACG AAATTCTGGTAGAACCTGCT Actin GTGCTCAGTGGTGGTTCAA GACGCTGTATTTCCTCTCAG 
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表 2 AcSWEET基因家族成员信息
Table 2 Information on AcSWEET gene family members
基因
Gene序列ID
Sequence ID蛋白质长度
Number of amino acids分子量
MW / Da等电点
Theoretical pI不稳定系数
Instability index脂溶指数
Aliphatic index亲水指数
Hydrophobicity scales亚细胞定位
Subcellular localization染色体位置
Chromosome locationAcSWEET1 Ach05g06950DH 68 7 531.83 8.03 29.09 117.65 0.469 叶绿体 5 AcSWEET2 Ach06g07770DH 245 2 7196.90 6.95 47.57 103.39 0.568 质膜 6 AcSWEET3 Ach06g08520DH 236 26 023.09 9.36 35.65 119.36 0.876 液泡膜 6 AcSWEET4 Ach10g04100DH 253 27 658.05 9.57 29.51 114.82 0.590 质膜 10 AcSWEET5 Ach10g10290DH 236 26 340.97 9.31 35.04 95.42 0.163 细胞核 10 AcSWEET6 Ach11g04370DH 252 27 746.95 9.37 34.26 109.44 0.512 质膜 11 AcSWEET7 Ach13g04100DH 288 32 042.07 6.99 36.66 120.14 0.694 质膜 13 AcSWEET8 Ach13g17010DH 234 25 814.53 8.80 36.02 111.58 0.684 质膜 13 AcSWEET9 Ach14g03170DH 198 21 765.16 9.71 29.99 120.51 0.703 质膜 14 AcSWEET10 Ach14g03210DH 186 20 525.26 9.91 31.15 117.96 0.334 质膜 14 AcSWEET11 Ach16g04520DH 103 11 850.58 4.93 40.50 73.79 −0.449 细胞质 16 AcSWEET12 Ach16g04530DH 136 15 558.83 9.44 31.10 129.78 0.856 质膜 16 AcSWEET13 Ach16g04540DH 287 32 139.66 9.39 38.65 117.46 0.778 质膜 16 AcSWEET14 Ach16g06160DH 238 26 764.96 9.10 37.01 115.46 0.671 质膜 16 AcSWEET15 Ach17g10410DH 275 30 968.82 7.61 35.74 111.35 0.656 质膜 17 AcSWEET16 Ach17g10420DH 132 14 617.52 9.08 49.24 108.71 0.679 叶绿体 17 AcSWEET17 Ach18g07250DH 250 28 204.71 9.37 44.39 115.76 0.554 质膜 18 AcSWEET18 Ach19g02550DH 296 33 224.04 8.46 35.78 130.57 0.841 质膜 19 AcSWEET19 Ach19g10330DH 304 33 198.18 9.49 29.29 111.48 0.346 质膜 19 AcSWEET20 Ach19g11300DH 906 101 266.08 9.61 46.80 86.35 −0.272 质膜 19 AcSWEET21 Ach21g07220DH 252 27 533.77 9.59 28.91 114.17 0.663 质膜 21 AcSWEET22 Ach23g12130DH 235 26 009.82 9.30 45.47 118.64 0.802 液泡膜 23 AcSWEET23 Ach24g12310DH 244 27 010.81 8.48 35.30 116.23 0.618 质膜 24 AcSWEET24 Ach25g05410DH 259 28 487.96 9.63 43.00 115.52 0.558 液泡膜 25 AcSWEET25 Ach26g07610DH 183 20 725.66 8.49 41.84 114.48 0.680 液泡膜 26 AcSWEET26 Ach26g09140DH 290 32 463.83 8.77 38.39 114.93 0.722 质膜 26 AcSWEET27 Ach26g09150DH 340 38 910.41 9.24 48.76 88.85 0.107 质膜 26 AcSWEET28 Ach27g01830DH 81 9 064.60 9.30 39.94 101.11 0.251 叶绿体 27 AcSWEET29 Ach28g11120DH 261 29 612.67 8.97 37.55 117.36 0.777 质膜 28 注：亲水指数为负值表示亲水性，正值表示疏水性；不稳定指数大于 40 为不稳定蛋白；脂溶指数小于 100 为脂溶蛋白。 Notes: For total average hydrophilicity, a negative value indicates hydrophilicity, while a positive value indicates hydrophobicity; Instability index greater than 40 indicates an unstable protein; Lipid solubility index less than 100 indicates lipid soluble protein.
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表 3 猕猴桃果实发育过程中糖含量及候选基因的相关性
Table 3 Correlation of sugar content and candidate genes at different developmental stages
指标
Item蔗糖
Sucrose葡萄糖
Glucose果糖
FructoseAcSWEET7 AcSWEET13 AcSWEET15 AcSWEET26 AcSWEET29 蔗糖 1 葡萄糖 0.960** 1 果糖 0.977** 0.975** 1 AcSWEET7 0.754** 0.664* 0.751** 1 AcSWEET13 0.677* 0.698* 0.694* 0.466 1 AcSWEET15 0.773** 0.686* 0.776** 0.972** 0.411 1 AcSWEET26 0.541 0.467 0.549 0.542 0.397 0.693* 1 AcSWEET29 0.904** 0.836** 0.915** 0.910** 0.566 0.934** 0.647* 1 Notes: *: P<0.05; **: P<0.01.
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